[問題] 請問抽取yeast plasmid

看板Biotech作者 (萬年豬)時間17年前 (2007/02/14 22:42), 編輯推噓8(8推 0噓 10→)
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最近在做抽yeast plasmid,再transformation 至 E.coli 不過抽取yeast plasmid 總是抽的很不穩定, transform 至E.coli的 plate colony幾乎不會長或是極少( n < 5 ) 因為市售的kit很貴 試了molecular cloning中的方法覺得很難用之後 從網路上找到了兩種prtotocol http://www1.qiagen.com/literature/protocols/pdf/PR04.pdf 跟 http://www.med.unc.edu/~hdohlman/plasmidisolation.html 這兩種都是用 mini-prep 的方法 再加入 beads 來抽取yeast的 plasmid 不過這兩種方法還是很不穩定, 失敗率還是很高 目前是已經先行排除後續trasformation的問題(非 competent cell, plate 等) 也並非yeast cell來源的問題( 同一株yeast 接出來抽,時好時壞) 而小弟的方法流程就跟上面的protocol一模一樣,兩種都試過,都時好時壞 想請問有先進是用類似方法做的很穩定又好的嗎? 希望有任何可以指點小弟的地方 感謝再先呀 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 220.139.222.8
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抽yeast plasmid,再transformation 至 E.coli ??這是?
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是yeast 2 hybrid後續要拿candidate出來嗎?
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有什麼奇怪 amplification 用啊
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假如是這樣的話我的經驗是PCR送sequence後問有沒有人有
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還比較快...XD
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我的經驗是要用電菌的 效率差很多 可能是plasmid太髒
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我猜原po可能為了要定序吧
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如果真的如我假設,那乾脆加熱破yeast後直接拿crude extract
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做heat shock送E. coli就好，還是會長......
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我前輩試過，據他的經驗用heat shock transform 出來真的很
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很少，建議用electroporation，efficiency好很多，真的。
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我做Y2H的時候也是要抽，但我是用electroporation，
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完全沒有這個問題...所以可以試試看。
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去買genemarl plasmid kit 很便宜.
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crude extract沒辦法用電的,一定會爆給你看XDD 太髒了...
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我連ligation product都會爆炸 @_@ 非得先純化才行
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而且heat shock送E. coli效率綽綽有餘,又比用電的方便很多
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推
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感謝各位提供不少意見:)這幾天小弟會再試試:)
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