[求救] Enzyme digestion 一直切不到但Plasmid PCR有band!!!

看板Biotech作者 (小魚ㄦ~)時間14年前 (2009/10/22 14:53), 編輯推噓9(9推 0噓 31→)
留言40則, 10人參與, 5年前最新討論串1/1
因為小妹做這個Cloning已經快5個月了...一直都卡在很奇怪的地方 所以想請版上經驗值豐富的大家的幫個忙~>"< 我想要Clone的gene片段大約是600bp PCR primer是設計了BamHI & XbaI的切位 我先用PCR產物接到T/A cloning vector(promega跟RBC都試過) 接著transform into DH5-apha還有TOP-10也試過 使用藍白篩選及Amp抗生素 挑白色的菌落做colony PCR 接著增殖有P到約600bp的菌 抽Plamid 取40.5ul的DNA + 5ul buffer 2 + 0.5ul BSA + 2ul BamHI + 2ul XbaI 37度 overnight . 3小時跟4小時都試過 可是最後跑膠確認時都沒有切下我想要的band... 應該說除了很亮的Plasmid的band之外都沒有其他的band = = 酵素是用NEB的 而且是新買的 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.128.62.203
推
10/22 15:03, , 1F
TA 完有定序嗎 有試過single digestion嗎
10/22 15:03, 1F
推
10/22 15:03, , 2F
是不是template放太多阿?
10/22 15:03, 2F
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10/22 15:08, , 3F
我送定序都定不出來= = single之前有試過 還是不行...
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10/22 15:10, , 4F
定序定不出來也很奇怪 明明PCR就有可是廠商都定不出來
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推
10/22 15:11, , 5F
TA完有用TA cite旁的酵素切切看大小對不對嗎？
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推
10/22 15:12, , 6F
定序跟colony PCR我會相信前者..
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TA那裡要先搞定確定有新增到你設計的RE切位才能繼續
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P出來的東西大小可能差不多 但沒定序根本不能確定是對的
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酵素新買的出問題機率不大 所以最有可能是TA你沒挑到
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TA用酵素切 有再送定序 定不出來有可能根本挑到接進去的
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10/22 15:39, , 11F
感謝大大的建議 我已經用TA上的切位正在試了
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10/22 15:40, , 12F
定序的sample我也有先抽plamid做PCR有差不多大小的band
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10/22 15:43, , 13F
就是奇怪的是都切不下來...
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推
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會不會切位上有甲基化所以切不動
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一定只能用這兩個RE嗎?? 可否換一個 BamHI和XbaI容易會
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甲基化 B:GGATCC X:TCTAGA 容易產生GATC
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今天用Vector上的EcoRI試了..只切到一管而且大小也不對.
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感謝大家的幫助!!! >"<
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現在老闆叫我再各挑10個菌落抽Plamid作測試 總共三盤...
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所以明天是Plasmid之日 = =
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推
10/22 23:22, , 21F
白菌有多少顆？挑多一點看看呀 有一個中就可以了
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推
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喔 我明白了 總共30顆
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祝你趕快挑到囉
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推
10/22 23:43, , 24F
EcoRI那邊有點怪，切一刀會產生正確大小的single band，切不到
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則是位置較低的supercoil form(明顯)
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這看起來怎麼像我們家學妹~~可是我們家學妹才開始2wks
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我從五月底就開始了....
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ksn大大~我比較笨聽不太懂耶? 哈哈不好意思
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hweichu大大我也發現這個問題了~感謝再沒辦法就換切位囉
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10/24 00:28, , 30F
今天抽了30管的Plamid外加一管藍色菌落跑膠發現藍色確實
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都比其他來的小 所以星期一會再試試看用 EcoRI去切
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10/24 00:31, , 32F
小女子非常感謝熱情的鄉民們~剛溫阿~結果出來再跟大家報
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10/24 00:32, , 33F
告~希望我可以向前邁進...>"<
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10/27 15:12, , 34F
昨天忘了上來po結果
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10/27 15:13, , 35F
結果竟然藍色的菌落也有切下大小約是我要的片段...
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10/27 15:13, , 36F
所以昨天也一併送定序了 又要漫長的等待了= =
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推
11/02 08:51, , 37F
可以用nebcutter切看看insert內有沒有vector上沒有的切位
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11/02 08:52, , 38F
single cut看看有沒有被切開
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11/11 01:48, , 39F
TA用酵素切 有再送定 https://muxiv.com
11/11 01:48, 39F
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01/03 17:02, 5年前 , 40F
定序跟colony P https://noxiv.com
01/03 17:02, 40F
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