[求救] 大分子量的蛋白質轉不過去! (350kDa)

看板Biotech作者 (坎比)時間14年前 (2010/07/01 22:57), 編輯推噓5(5推 0噓 6→)
留言11則, 5人參與, 最新討論串1/1
最近剛嘗試跑大分子量的蛋白質電泳,分子量為350kDa,在transfer部分遇到 大瓶頸, 麻煩板上的大家幫忙一下!! 我的條件是, 濕式轉漬法, 固定電流300mA, 為時兩小時, Transfer buffer:含Glycine& Tris-base, 20%MeOH (因為我跑分子量80kDa,條件為300mA/90分鐘,就天真的選用這個條件 囧), 之後 把Gel用Coomassie染色後才發現,根本沒過去... 爬了板上的文, 發現大家似乎有在加入SDS幫助轉漬效率,想請問一下大家的方法與條件!! 另一方面, 在跑gel方面,我是跑6%的gel,條件為 固定電壓130V/150分鐘,因為marker 最大只到170kDa,所以都是憑感覺抓位置的,不知道板上的各位Running的條件也差不多嗎? 還有就是Running完,buffer都燙燙的,這樣可以嗎? 謝謝大家了!!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 120.126.97.10
推
07/02 17:07, , 1F
MeOH會影響大分子量的蛋白轉漬 建議可以不要加
07/02 17:07, 1F
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07/02 19:37, , 2F
減少你的MeOH(MeOH幫助fix),增加你的SDS(SDS幫助游離)
07/02 19:37, 2F
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07/02 19:38, , 3F
另外請整個抱去冷房裡面跑~底部加著stir轉轉幫助對流散熱
07/02 19:38, 3F
推
07/02 20:30, , 4F
推樓上
07/02 20:30, 4F
推
07/02 22:37, , 5F
400mA,2.5hr 250kDa可以,如果不想換buffer 試試看時間拉長
07/02 22:37, 5F
推
07/02 22:39, , 6F
對了,是埋在冰裡或加冰包transfer
07/02 22:39, 6F
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07/03 03:26, , 7F
請問一下,MeOH2的減少與加入SDS的配方建議是? 謝謝!!^^
07/03 03:26, 7F
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07/03 03:27, , 8F
還有假如調整了buffer的配方,電壓的參數是否也應該有所調整呢
07/03 03:27, 8F
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07/03 03:39, , 9F
網上的資訊是加入0.05%的SDS,但似乎沒有改變MeOH的比例,不知
07/03 03:39, 9F
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07/03 03:41, , 10F
這樣的條件是否得宜? 謝謝各位了!!!
07/03 03:41, 10F
推
07/03 23:24, , 11F
MeOH 10% SDS 0.05% 400mA 2.5hr try it :)
07/03 23:24, 11F
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