[求救] western blot很奇怪的髒法
各位先進好
我們研究室最近才剛成立分生的部分 所以很多東西都還在嘗試
最近在抓L牌的半乾式轉印 i○lot2 以及後續接抗體時遇到了很多問題
像是常見的大分子轉不夠 小分子全跳海
或是marker都轉過去 sample還留了一半多在膠上 (用coomassie blue染過)
甚至GAPDH的轉漬靠邊緣的band會呈現三角形這種不均勻的狀態
不知是否有先進已經掌握這台的特性能夠指點一二
以下是主要問題
最近在冷光呈色時發現會有如下圖的直向污漬
http://i.imgur.com/CAlF1Nh.jpg
由於跑膠本身也是使用L牌的gradient gel 及其電泳槽
轉漬也是用他的stack跟program
之後
剪膜
T牌的TBST blocking buffer 1hr
TBST wash 15min*3
一抗 4度 overnight
TBST wash 15min*3
二抗 1hr
TBST wash 15min*3
wash大力搖 接抗體輕輕搖
其他蛋白都沒有相似現象 唯有collagen I 會出現這樣的直向污漬
不解的地方在於為什麼會是直向的? 如果是blocking出錯應該是整片髒
抗體有問題的話也應該是整片亂接
而這邊感覺又像是有點規律 不知是否有前輩遇過相似的情況?
*使用MG63及hpulp兩種人類細胞
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.34.108.149
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1422370397.A.AF0.html
推
01/27 23:13, , 1F
01/27 23:13, 1F
推
01/27 23:24, , 2F
01/27 23:24, 2F
T牌這部分只買了blocking buffer 其他都是L牌的
可是我們這邊的L牌業務很...(略
問他也只會說他其他客人都沒問題
目前正在想辦法減低跟他的往來這樣
T牌業務很盡責每天都來 不過好像問題不在他身上
→
01/27 23:56, , 3F
01/27 23:56, 3F
→
01/27 23:58, , 4F
01/27 23:58, 4F
→
01/28 00:02, , 5F
01/28 00:02, 5F
正是如此 所以樓上也有過類似經驗?
※ 編輯: martinyang13 (114.34.108.149), 01/28/2015 00:49:25
→
01/28 07:28, , 6F
01/28 07:28, 6F
是純化的
推
01/28 08:33, , 7F
01/28 08:33, 7F
但是我們用coomassie blue染轉漬後的膠上並沒有出現這樣的拖曳痕而是清楚的band
也有直接染過未轉漬的膠 同樣也是條條分明
圖中的拖曳痕甚至比band還亮 不太可能coomassie blue染不到吧?
※ 編輯: martinyang13 (140.112.135.180), 01/28/2015 10:07:24
→
01/28 10:15, , 8F
01/28 10:15, 8F
推
01/28 15:16, , 9F
01/28 15:16, 9F
stack裡面的 應該是PVDF膜吧
有 膜上也是band很清楚 沒有這種直條的
未轉漬的膠
http://i.imgur.com/2M9Vg2I.jpg
※ 編輯: martinyang13 (140.112.135.180), 01/28/2015 15:46:00