[求救] lysis buffer是否要含imidazole

看板Biotech作者 (handsome)時間9年前 (2015/03/21 21:01), 編輯推噓4(4推 0噓 9→)
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Lysis buffer: 50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole和PMSF Wash buffer: 50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imidazole Binding buffer: 50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imidazole 菌體:E. coli 首先菌養完離心後用20ml Lysis buffer回溶，在超音破菌後，離心取上清液，接著與 Ni-NTA樹脂2ml混合，在冰上搖晃2hr，倒入滴管收集流出液，之後再用wash清洗， elution洗出目標蛋白，western後結果，蛋白都在流出液和wash的部分，所以有以下問題 想請教各位 問題: 1. Lysis buffer中imidazole功用是?那會影響蛋白與樹脂的結合嗎? 2.如何提高蛋白和樹脂的結合能力，才不會蛋白都在流出液和wash的部分 麻煩各位給小弟解答，謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.104.81 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1426942909.A.11B.html
推
03/21 23:17, , 1F
少量的imidazole是要減少non-specific binding
03/21 23:17, 1F
推
03/21 23:19, , 2F
你target protein的表現量高嗎？如果只有一點點 可能都被
03/21 23:19, 2F
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03/21 23:19, , 3F
你lysis buffer中的imidazole compete掉了
03/21 23:19, 3F
推
03/21 23:57, , 4F
你有先把bead的酒精去掉嗎？buffer的pH很重要，Ni-NTA應
03/21 23:57, 4F
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03/21 23:57, , 5F
該是Qiagen的，protocol應該有寫得很詳細。如果你的東西
03/21 23:57, 5F
推
03/25 00:42, , 6F
我們用Talon Bead 一樣是抓His Tag
03/25 00:42, 6F
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03/25 00:43, , 7F
讓你參考一下 Lysis bf. 不含imidazole
03/25 00:43, 7F
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03/25 00:44, , 8F
binding bf.= Lysis bf. resin使用前會先以binding bf
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balance數次(如果lysis bf.含detergent balance時我會
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03/25 00:46, , 10F
先把detergent拿掉(應該是不影響 只是怪習慣而已)
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wash bf.只含5mM imidazole 有時視蛋白種類還會再降
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03/25 00:49, , 12F
Elution才使用高濃度(e.g. 100~500mM)imidazole洗脫
03/25 00:49, 12F
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03/28 15:30, , 13F
謝謝各位答覆，小弟我會在try看看
03/28 15:30, 13F
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