[求救] HMW protein detection
版大們晚安
小弟最近在處理一個~250kDa的protein
但western一直都壓不太出來....(以下會詳述)
有逛了一些討論版 但還是做不太出來/很醜
因此想上來請問一下大家的看法
1. 由於我的protein是lipo外送的
理論上量會很多 (以前paper也很多人做過)
我是想問 如果我今天送一樣量 (ex:10ug的DNA)
一個是表現10kDa的蛋白 一個表現250kDa
兩個表現量會有差別嗎? (還是一定要考慮protein的modification)
2.Cell lysis
目前是用0.2% NP40 lysis bfr做 學長之前做出來的條件
rocker 轉+ vortex 15min (會太短嗎? )
也因為此protein會secrete, condition medium會外加至0.2% NP40 & 1mM PMSF
去掉cell debris後放冰上
之後Lysate 跟medium 做IP o/n, wash三次後加2x smp bfr 煮
(有試過不IP直接跑 看不到一點痕跡
別的實驗室做此protein, 即便是外送 都還是會IP 所以照做)
3.SDS-PAGE
我之前是跑4%的gel 但我上膠是5%....
這會影響嗎? (跑出來是歪歪扭扭的沒錯 但想確認; pH上6.8下8.8)
跑膠條件: 90V 約2hr ( Biorad tetra cell system)
Running bfr 是tris-Glycine SDS (就一般用的)
Marker是Thermo 的Spectra MR (Max 300kDa)
PS 此情況下 marker位置準嗎?
4.Transfer
條件是根據討論版的結論測的 125mA 120mins
Transfer bfr: Tris-Glycine / 10% MeOH / 0.05% Tw20
(建議SDS或tw20或不加的都有,我就用較weak的)
transfer完後 marker都有過去
後續處理就是一般的western方法 之前做到130kDa的protein都沒問題
(抗體的部分 因為我學長壓的出來 所以應該不是這問題
但跟一般100kDa以下的壓出來算是不太好看 )
就這個250的一直壓不出來...
希望大家能給一些意見~~
謝謝
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因為不只我們實驗室啦@@...10幾年前的paper~最近 用Hela/COS-7做外送 還是會先用IP enrich (或是TCA 沉澱)
而且抗體跟我們家現在用的不同隻
我也想過這東西真的有少到一定要IP嗎 所以才有 1. 的問題
但我要認真想一下我家抗體是不是壞掉...囧
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目前也正改用6% gel
想請問一下B大的跑膠及transfer條件是?
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還在XD 但他習慣跑大片膠 我不太會處理大片的 所以跑小的
因此跑膠condition有些差異
剩下基本上是完全發樓
推
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J大說的就是我一開始想的點...
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謝謝b大 你順便幫我解決了一個快兩年的問題....
那假若我今天在兩個protein後都接Flag 並用flag 做western 應該可以解決抗體的問題?
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plasmid跟seq都是對的喔 Hela transfect大概6~7成,細胞狀態應該OK
其實大膠我會 就只是單純覺得如果小膠可以 為何不能跑小的就好 (因為就看一條band)
※ 編輯: tynse71864 (36.225.70.25), 05/13/2016 12:23:00
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因為我的 wt跟 mutant protein, 每次外送 結果表現量都不一樣多 (但 wt一定比較多,只是看多幾倍); 但試過接 flag後外送, IB Flag 表現量就會一樣。 抗體是bacteria recombinant wt protein打兔子來的
※ 編輯: tynse71864 (42.73.20.24), 05/13/2016 20:29:34
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※ 編輯: tynse71864 (1.171.39.66), 05/15/2016 11:18:41
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