Re: 請問怎麼把蛋白質從PAGE上elute出來?
※ 引述《aggaci (有氣質的台客)》之銘言：
: ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言：
: : 雖說你說不要用電極.. 但還是提供一個用電極且省錢的
: : 我們實驗室有 electroelutor.各家的都很難用 又貴(當初我試過三大廠牌 都不及格)..
: : 另一個方法是將膠切下來 包在透析膜裡 丟到水平電泳槽 把蛋白質電出來
: : 那你怎知蛋白質被電出來了沒?..
: : 簡單.. 準備一個透析膜 裡面包經過 CBG-R or G 染色的 band
: : (隨便找個load個蛋白質跑 SDS PAGE 跑完染膠後切下來)
: : 這個 control 組與你的 target protein 兩包透析膜一起丟到水平電泳槽一起電
: : 這當成 control 如果蛋白質被電出來了 這個control 組的顏色就會變淡
: : (藍色被電出來)
: : 你的蛋白質就可以收了.. 透析膜剛拿出來不需打開 直接透析濃縮 蛋白質就出來了
: : 電極方向也不需太擔心 即便因為是 native PAGE 蛋白質帶電荷不同 跑反了
: : 你的蛋白質仍是被限制在透析膜跑不出來
: : 活性都好好的..
: : 這方法比買又貴又難用的 electoelutor..
: : 或是用超音波震 回收率都沒太糟..
: : 這方法注意兩個重點..
: : buffer 要適當
: : 再來是透析膜綁好.沒綁好被電出去我也沒辦法
: 透析膜阿?
: 可是切下來的gel不就小小一塊
: 用到透析膜感覺像是buffer相對於gel要加不少吧?(1 cc要嗎?)
: 那降子不就被大量稀釋了
先解決 R大的問題..
.. 呵呵 注意我的文章.
我的文章只說 control 組要染 因為這是對照組
我可沒說原po 的 target protein要染喔
因為對造組不染的話 你無從觀察到底電出來沒阿..(從dye 的 difussion)
至於不染怎知你的 target protein 在那?..
當然最簡單是對造 western 的 preblue marker 阿
不然用 UV 觀查都行
當然有其他撇步能看到protein又不傷蛋白質的方法... 原po前述方法不行在說..
在來是 原po的問題
當然 如果你protein多的話 當然是用厚膠不加well 整個砸下去
protein 少的話, 1cc buffer 算什麼問題
用centricon 濃縮就好啦.. 怕蛋白質少的可憐的話 離一離不見了
不介意 denature 的話
把電好的透析一下 拿去冷凍乾燥..(你不透析 乾燥完出來的都是鹽)
1cc冷凍乾燥應該不須一小時吧...
至於去除DNA呢?...
你 plasmid 怎麼抽的就是怎麼解決阿...
DNA 完全帶負電 (相較於蛋白質的話)
要我就 denature 蛋白質後用 類似像 DEAE 的 gel 應該夠把蛋白質分開了
當然 我個人很懶.. 連 packing column都很懶..
如果我是你就把 蛋白質煮一煮 直接loading 進 PCR clean up 的 column
離心下來後的東西應該是你的蛋白質 而 DNA bind在 column的 gel 上
在用kit的 buffer wash 一下 說不定你的 probe 還可以回收使用哩...
成本... 20 塊錢....
試試何防?..
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