Re: [問題] Real-time PCR
※ 引述《bloodgas (奶油ˊ的夢)》之銘言：
: ※ 引述《lakerjackt (NN )》之銘言：
: : 有人用過從血液中抽出的cDNA做real-time PCR嗎?
: : 因為本身是用ABI的機器run real-time PCR...
: : 但一直try不好PCR的condition...
: : 不然就是有出來後...再做一次就沒出來了...
: : 且Ct值一值都滿後面的...40上下...
: : 所以一直做到沒信心...><
: : 所以我想請問各位real-time PCR幾個問題..以解笨小弟我的疑惑..
: : 1.real-time PCR做的時候,反應的量一定要加的很精準嗎???
: : 2.ABI的real-time PCR是不是都不用設定annealing..這樣一定都做的出來喔??
: : 3.因為我是用kit抽RNA,但是是用一般方法轉cDNA..所以會有可能cDNA轉的不好嗎?
: : 4.請問有人用invitrogen這家的kit抽RNA嗎?...做後續效果都可做很漂亮嗎??
: : 5.請高手幫我想一下我該怎麼辦...謝謝...
PCR有一個重要的公式
y=(1+e)^n e是PCR反應的效率,而n次方指的就是cycle number
就我所知real-time PCR,是希望每一個PCR反應能盡量達到 e=100%
所以才會限制產物大小 (<250 bp) 跟反應溫度(2-step PCR)
當然對於template的要求也是非常的高
如果你的template quality不佳,做出來的結果常常會認你吐血
(我在做基因定量,range只有1-4 copies,但是Ct差個1結果就差兩倍,真的會吐血
觀察國外這方面做的好的實驗室,對於template的quality要求是嚴格到不行)
如果你都按照他的限制下去做,基本上他們是可以保證一定可以得到很好的結果
但是溫度是絕對可以調整的
如果你的基因在3-step PCR做的2-step PCR還好,當然沒有理由不調整溫度
(這又牽涉到primer的設計,所以他們也出了一套軟體專門幫你設計適合的primer)
只是你要確定這樣條件下的e比他們條件下的e來的好
另外,反應體積也是要盡量精確,因為reagent裡還有ROX dye,
機器會在判讀時拿這個螢光作為不同well之間體積的校正
(但是怎麼校正我就不清楚了,有興趣者可以自行測試,再來跟大家分享嗎?)
不過一我的經驗,差個1-2 micro-liter是影響不了多少啦!(我做25 micro-liter的)
RT Real-time我也做過,用的是TRIzol抽的
OD 260/280實在不怎麼好(說來慚愧,1.6我就歡天喜地了)
但是也都做的出來
剛開始還傻傻的買他的one-step RT-PCR reagent(貴到爆)
後來也開是自己轉(我用過BD以及invitrogen的kit)
但是結果仍然滿意,所以抽RNA跟RT的kit應該是影響不大
反而是你操作的好不好的問題
另外你的反應做大於40 cycle,然後Ct只會在40以後出現
我也如bloodgas大大會建議你看一下internal control的Ct會在多少出現?
可以一併確認是quality的問題 或者你的基因表現就是低到不行
希望對你有所幫助
: 1.是的,要盡可能精準
: 2.我們實驗室用的是Roche的機器,不過所有program的溫度跟時間都可以調整,因為每一個
: 基因都不一樣,同樣的條件不可能適用於所有PCR,所以一定要optimization,ABI機器
: 沒用過,所謂的不能改條件意思是????
: 3.RNA用column抽或是TRIZOL抽都一樣,quality沒問題,reverse transcription只要沒有
: RNase污染就沒問題
: 4.要check RNA quality就直接跑個gel來看,28S/18S的band正確,比例也正確就可以
: 5.crossing point 40是太低了,應該就是沒有東西吧...你測過抽出來的RNA的濃度嗎?
: 你是用多少total RNA下去做reverse transcription? 一般都用0.5-1 ug, 另外,
: 你做過house keeping gene的real-time PCR嗎?這樣可以直接確定你的cDNA有沒有問題.
: 還有一點就是可以加上一個positive control,plasmid或是PCR fragment,這樣才能
: 確定至少real time PCR的過程沒有問題..
: 以上
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◆ From: 163.15.174.204
推
12/16 17:56, , 1F
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