Re: [求救] 誘導表現蛋白質
※ 引述《u8524009.bbs@ptt.cc (VIP好人卡....)》之銘言：
> ※ 引述《Talen (找到答案了~)》之銘言：
> : 最近正在做表現蛋白質的實驗
> : 利用pET30a接入欲表現的蛋白質(約30 KD)後
> : 送入BL21(DE3)中 加入IPTG以誘導表現出蛋白
> : 目前誘導表現情形很順利 28度C 6小時
> : 在破菌前有取 200 ul 確認過有誘導出來
> : 但問題是每次在破菌後 我要表現的蛋白質會減少很多
> : 不知道是什麼問題?
> : 希望各位前輩能提供一些建議 感激不盡～
> : 破菌的方法：
> : Sonication 強度為３或４都用過 打十秒 停十秒 共１０分鐘
> : French press 使用大 Cell
> : 但都依樣結果
> 要先問一下你所謂的破菌後蛋白質少很多..是你用那一個fraction去跑膠得到的結果
> 不曉得你有沒有測過你的目標蛋白質是soluble form還是inclusion body?
> 假設你的蛋白質是inclusion body,而你取上清液去跑膠;
> 亦或是你的蛋白質是soluble form,而你取離心後不溶的pellete去跑膠
> 都會得你像你所說的破菌後,蛋白質減少很多的現象
照你的描述 最可能就是被破壞掉了
你當然可以加PMSF
但我猜效果大概不大
破菌的過程蛋白質被降解的機會很小
另一種可能的辦法是 換到Novablue (DE3)表現
也許可以解決
雖然你說有測過 我覺得比較可能的是很多都跑到沉澱物的部份去了
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※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
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推
05/09 09:39, , 1F
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