Re: [求救] Western Blot出來的band不清楚
※ 引述《soceress (贏了世界又如何)》之銘言：
: http://www.wretch.cc/album/show.php?i=steniralc&b=2&f=1288829228&p=0
: 箭頭所指的地方是我的target protein
: blocking是用5% 脫脂奶 1hr
: 一抗是1:1000 ,cell signaling的產品 overnight
: 在5% BSA中稀釋
: 二抗是1:2000 ,Jackson的產品 1hr
: 在5% 脫脂奶中稀釋
: 但呈色後會有點點(如圖),target地方也很不清楚,有水痕
: 本來我一抗是一樣用脫脂奶稀釋,其它都一樣
: 呈色後跟這張圖的問題一樣--target protein很糊,有水痕,但沒有點點
: (所以不是transfer有泡)
: 於是strip後一抗換成datasheet上的5%BSA去稀釋,還是一樣
: 這兩張membrane的其它部份做的band都非常正常,用的buffer也都是一起配的
: 請問這是抗體的問題??
: 還是在染的過程中哪個小細節沒注意到的??
: 請大家賜教~ 感激不盡!!
你這問題我之前遇過,不要再猜了...
1.你二抗用太高，因為二抗太高,訊號一下子就反應光了,不要再提高抗體濃度
二抗用1:10000-15000，一抗就照原廠建議
2.水痕是二抗太高造成的背景，不是transfer的問題，絕對不是!!!!!
你再把cassette上夾membrane的膜再放一便會好依點不過只是治標，治本方式是稀釋二抗
3.二抗請重復使用...不是因為要省錢，是因為效果比較好
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討論串 (同標題文章)
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