Re: [求救] his-tag純化蛋白
※ 引述《s992003 (Lord of Ethanol)》之銘言：
: 不常發文，排版差見諒
: 小弟最近在重複學姊的實驗，用His-tag純化蛋白
: 但是不管怎樣都不純，蛋白量也不多
: 實驗條件是先以含有表達序列的pET28a 載體放入BL-21菌株中
: 接著塗盤篩選挑菌放入含有50ug/mL的LB broth中培養16小時
: 接著各加5mL的菌液到兩瓶500mL的LB broth中培養至600nm OD=0.5~0.6
: 再加入IPTG使最終濃度為1mM 刺激表達蛋白4小時收菌
: 以10000g離心30分鐘，
: 用50mL的buffer(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,1mg/mL Lysozyme,1mM DTT,0.2mM PMSF,1% Triton pH=8)
: 將1L的菌 pellet沖起，凍入-80°C到隔天
: 沖水快速解凍後，冰上sonication 5分鐘(on 30s off 30s，共10分鐘)
: 接著與1mL NTA-beads於離心管中搖晃binding 1小時
: 收集beads之後填入管柱中
: 接著以50mL的10mM imidazole,50mM NaH2PO4,300mM NaCl的buffer沖洗
: 再以30mL的20mM imidazole沖洗
: 再以20mL的30mM imidazole沖洗
: 再以10mL的40mM imidazole沖洗
: 再以10mL的60mM imidazole沖洗
: 接著以4mL的250mM imidazole elute
: 收集清洗液40mM,60mM前面500uL 以及5管elute溶液 250mM 700uL跑膠
: 目標蛋白:紅框裡面，綠色及藍色ladder中間那條，約30kD
: 結果60mM看起來清洗掉很多雜蛋白但非常不純
: 附圖:左到右40,60,250,250,250,250mM imidazole
: http://imgur.com/a/wlLg5
: 後來老師認為既然雜質蛋白太難洗掉，那降低pH值降低所有蛋白對NTA-beads的親和力
: 反正含有His-tag的蛋白應該還是會牢牢的吸附在beads上
: 此外也不要搖晃binding 1小時，改用流過beads的方式binding就好，減少雜蛋白和beads作用的時間
: 因此新的條件將所有buffer改成pH=7.5
: 此外老師認為pH=7.5之下蛋白比較容易掉下來，所以清洗的gradient應該要改，鹽類濃度也可以降低
: 所以imidazole洗到50mM就好，並且elute的NaCl濃度改成150mM
: 後面elute改成各用1mL的60,80,100,120,140,250mM imidazole
: 結果看來50mM清洗效果不佳，純化的結果更加不純
: 附圖:左到右50,60,80,100,120,140,250mM imidazole
: http://imgur.com/a/tkv0g
: 小弟對於自己的情況有一些問題
: 首先老師表示:
: 正常來說His-tag純化 30mM imidazole濃度就應該會把雜質洗掉，再提高濃度會把目標蛋白也洗掉，一定是我的蛋白表現量不好
: 再來就是因為管柱是用人工填充的，也是手動控制流速，老師認為這樣再現性本來就不佳，要我操作更加謹慎
: 但表現量是學姊已經測試過的，難道是後來我再做，凍在-80的菌株已經不健康了?
: 另外我跟老師表示NTA-beads的protocol本來建議用pH=8,300mM NaCl進行實驗，但老師認為protocol是死的，人是活的，不要太重視它
: 可是現在做了幾次下來，都是原先的pH=8,300mM NaCl看起來效果最好
: 我又表示那如果我用2L的菌液去純化，增加目標蛋白的總量去填滿bead的空間使雜蛋白不易吸附，而且目標蛋白增加，也可以用稍高濃度的imidazole清洗，儘管目標蛋白有流失，最終也可以以量取勝
: 但老師認為如果我表現量不佳的話，就算增加表達的菌液培養量，目標蛋白佔細菌總蛋白的比例還是不變，情況並不會有所改善
: NTA-beads是Qiagen的
: http://imgur.com/a/z7RfY
: his-tag純化已經是個很常見的方式了吧，想請問有做過的大大們這方面的經驗如何呢??
剛開始你的確是試了一些純化條件，而無法解決問題
這時候，你要跳脫原先的思維，不然就被框架限制了
兩個問題,
1. 你的target protein 是否有在純化或是表現中降解？或是aggregated?
如果是這種情況發生的話，因為這些protein 可能都帶有his tag
你怎麼調整 Ni column 純化條件也是於事無補
如何得知？ 做個 western 即可確認
2. 你的target protein 是否有可能跟細菌內的其他蛋白質有interaction?
一旦這情況發生，雜蛋白質就是會隨著你的target protein 被 eluted 出來
這時候就要考慮第二根 且不同類型的column，
而不是死卡在 Ni 純化條件的調整
以我在國內外超過快二十年的純化經驗，BL21 內的內生性蛋白質 （所謂雜蛋白質），
無以上兩種情況，Ni column 都很好純化出來。
good luck
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