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作者 lier1986 的總覽 (PTT發文,留言,暱稱)

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lier1986 在 PTT 最新的發文, 共 8 篇

請問BL21(DE3)pLysS的耐毒性測試

[ Biotech ]0 留言, 推噓總分: 0

作者: lier1986 - 發表於 2012/03/15 15:12(12年前)

[求救] 質體轉不進表現菌株~請問有什麼辦法解決

[ Biotech ]46 留言, 推噓總分: +10

作者: lier1986 - 發表於 2012/02/29 15:28(13年前)

[求救] 將建構好的質體放入expression host

[ Biotech ]27 留言, 推噓總分: +7

作者: lier1986 - 發表於 2012/02/15 18:37(13年前)

請問大家ligation時ligase使用的量

[ Biotech ]8 留言, 推噓總分: +5

作者: lier1986 - 發表於 2011/12/09 20:41(13年前)

[討論]DNA ligation時 260/280的值重要嗎?

[ Biotech ]8 留言, 推噓總分: +3

作者: lier1986 - 發表於 2011/11/24 20:57(13年前)

lier1986 在 PTT 最新的留言, 共 117 則

[求救] 質體轉不進表現菌株~請問有什麼辦法解決

[ Biotech ]46 留言, 推噓總分: +10

作者: lier1986 - 發表於 2012/02/29 15:28(13年前)

4^F→lier1986:blence沒錯02/29 17:35

11^F→lier1986:stop codon是在plasmid上也沒有被限制酵素切掉03/01 16:15

12^F→lier1986:所以應該不是這個問題03/01 16:15

13^F→lier1986:我在想是不是因為質體大小的差異影響到轉型效率03/01 16:17

28^F→lier1986:樓上大大...時間我已經不記得了TAT...03/05 12:48

29^F→lier1986:電完之後放在37度LB培養一小時這個動作我有做03/05 12:49

30^F→lier1986:但是離心取pellet倒是沒試過但我是有把所有的菌液都塗03/05 12:51

31^F→lier1986:盤03/05 12:53

32^F→lier1986:plasmid 的大小跟insert DNA的大小都跑過電泳確認了03/05 12:54

33^F→lier1986:從XL1-blue抽出來plasmid的量也用nano drop測過03/05 12:55

34^F→lier1986:抽出來的plasmid濃度最高到122ng/uL 應該是沒問題的03/05 12:59

35^F→lier1986:這幾天又做了別的實驗如同micocat所說03/05 13:02

36^F→lier1986:將plasmid轉到XL1-blue和BL21(DE3)pLysS中03/05 13:04

37^F→lier1986:轉到XL1-blue長了很多但轉到BL21(DE3)pLysS就不長03/05 13:04

38^F→lier1986:但這個結果我覺得不能證明我的蛋白有致死性03/05 13:05

39^F→lier1986:因為如同我文中所講 pLysS是會抑制insert DNA表現的03/05 13:06

40^F→lier1986:我的盤子上只有抗生素沒有IPTG 基本上重組蛋白是不會表03/05 13:07

41^F→lier1986:現的03/05 13:07

42^F→lier1986:反而更讓我覺得應該是有什麼原因使得plasmid轉不進去03/05 13:07

45^F→lier1986:嗯我自己做也是這樣轉pET20b很簡單03/06 15:23

46^F→lier1986:但是有insert的轉了就是不會長03/06 15:23

[求救] 將建構好的質體放入expression host

[ Biotech ]27 留言, 推噓總分: +7

作者: lier1986 - 發表於 2012/02/15 18:37(13年前)

12^F→lier1986:insert的方向應該是沒有問題的我是用兩個不同的RE切的02/17 12:29

13^F→lier1986:沒成功是指沒長colony沒錯我也覺得可能是protein有毒02/17 12:30

14^F→lier1986:但是我使用了BL21(DE3)pLysS當host 但還是得到一樣的結果02/17 12:30

15^F→lier1986:使用沒有insert的pET20b當control就有長菌02/17 12:31

16^F→lier1986:有insert的pET20b就沒長菌02/17 12:32

17^F→lier1986:ng單位是沒寫錯的一般我看到的protocol也是用ng02/17 12:33

18^F→lier1986:我的經驗也是只要使用1ng的plasimd就可以長整盤的菌02/17 12:34

19^F→lier1986:使用電穿孔的方式是因為實驗室大部分都是用這種方法02/17 12:35

20^F→lier1986:序列檢查的部分我確實還沒做我們老闆是覺得能夠表現重組02/17 12:38

21^F→lier1986:蛋白之後再去確定序列是否正確02/17 12:39

22^F→lier1986:我想不通的地方是明明plasmid是從XL1-blue裡抽出的02/17 12:41

23^F→lier1986:但放到BL21(DE3)卻沒辦法長我一開始一直以為是vector02/17 12:42

24^F→lier1986:上的antibiotic gene壞掉但應該不是02/17 12:43

[討論]DNA ligation時 260/280的值重要嗎?

[ Biotech ]8 留言, 推噓總分: +3

作者: lier1986 - 發表於 2011/11/24 20:57(13年前)

6^F→lier1986:clean up是都有做的只是我做完之後看260/280的值11/25 16:26

7^F→lier1986:好像沒有到很標準的程度所以才會問是不是DNA的品質11/25 16:26

8^F→lier1986:不夠好會影響到ligation的結果11/25 16:27

[求救] cloning已經做了5個月...

[ Biotech ]58 留言, 推噓總分: +9

作者: lier1986 - 發表於 2011/11/14 15:07(13年前)

3^F→lier1986:可是我學長他用NdeI也是多兩個G就可以做得出來@@11/14 16:32

4^F→lier1986:competent cell 就是有用過positive control 也不會長11/14 16:33

5^F→lier1986:我老闆是說自製的competent cell 過程要快11/14 16:34

6^F→lier1986:但光是分裝就要分幾十管怎麼快得起來...11/14 16:35

9^F→lier1986:我們lab是用電穿孔所以製作competent cell的buf.沒有用11/14 18:35

10^F→lier1986:沒有用CaCl2 是直接用10%的甘油11/14 18:36

25^F→lier1986:更可靠的competent cell protocol有人可以提供嗎?11/15 12:24

26^F→lier1986:我現在就是在用TA clone 但是成功率還是很低...11/15 12:25

27^F→lier1986:我是有發現放四度C有些白的菌落會變藍色但大概要放多久11/15 12:25

28^F→lier1986:我知道RE site前多的bp確實是有點少11/15 12:27

29^F→lier1986:但多了幾個bp就真的做得出來嗎...?11/15 12:28

30^F→lier1986:stock菌是學長給我的品系是XL1-blue有什麼方式可以確認11/15 12:31

31^F→lier1986:stock對或錯嗎?11/15 12:32

32^F→lier1986:電穿孔的機器設定上應該是沒問題的 positive control有11/15 12:33

33^F→lier1986:長出很多菌11/15 12:33

34^F→lier1986:感謝各位提供的意見11/15 12:42

40^F→lier1986:boyo這個id好像有點眼熟...該不會是PTT的那個名人吧@@11/16 21:51

41^F→lier1986:話說基隆米克斯的東西有什麼問題嗎??11/16 21:52

46^F→lier1986:competent cell是一個大問題沒錯我一直摸不著頭緒11/21 14:03

47^F→lier1986:到底我做的competent cell是哪邊出了問題11/21 14:03

48^F→lier1986:那我現在在參考molecular cloning的方式正在嘗試11/21 14:04

49^F→lier1986:那TA cloning的部分我之前用的competent cell是學長做的11/21 14:05

50^F→lier1986:也確認過他做的competent cell是可以用的11/21 14:06

51^F→lier1986:只是效率應該是沒有到0.1 ng DNA 長100 colonies這麼高11/21 14:09

52^F→lier1986:但在做ligation & transformation後還是可以長出菌落11/21 14:10

53^F→lier1986:可是藍白篩中卻有很高的偽陽性問題到底出在哪...?11/21 14:11

56^F→lier1986:A應該是有加我是用Taq polymerase 理論上應該是有11/22 11:58

57^F→lier1986:vector是買kit的裡面的plasmid是linear form的11/22 12:01

58^F→lier1986:應該也是有用phosphatase處理過的才是...11/22 12:04

[心得] 波多野結衣我覺得沒事

[ japanavgirls ]77 留言, 推噓總分: +53

作者: assistking - 發表於 2011/03/12 19:45(14年前)

73^F→lier1986:經紀人?蒼子小姐?阿怎麼又有人說經紀人是男的03/13 15:40

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