Re: [問題] western blotting!! 常抽到DNA!!造成拖 …
※ 引述《killmebaby (不錯喔)》之銘言：
: 最近做western blotting時,不知到是cell lysate處理的不好,還是怎樣,都會抽到DNA,
: 造成在跑SDS-PAGE時,都會看到明顯的拖帶現象..
: 試過離心多次一點,或是lysis buffer加多一點,但好像都沒有改善,還是會隨機的
: 抽到DNA.
: 可以請大家告訴我幾個方法嗎?快被這一點搞昏了....
: 謝謝大家!!
: 我的protocol:
: 1.using cold DPBS to collect cell
: 2.RIPA lysis buffer(我怕說是不是太強,打破核膜,才會拿到大量的DNA,因為我們
: lab要看細胞膜上的蛋白質,所以lysis buffer要強一點)
有sonication 就不用再去擔心有沒有打破核膜的問題
還有要看的如果是膜蛋白，應該有比RIPA 更好的配方
RIPA其實是最適合看細胞質內soluble protein的
: 3.加lysis buffer to cell pellet(我大約都加150ul/(3*10)6 cell
: 4. vortex 2 minor longer
: 5. sonication 5 min
如果你很確定拖帶的現象是DNA造成的
那sonication 就是關鍵
我看過很多sonication 的protocol
都是幾分鐘... 或多少怎樣（視機器）的設定幾次的
這實在是非常奇怪的一件事
每次收集到的樣本不一樣、濃度不同
sonication 要做的份量也就不一樣
sonication 真的抓到點，整個振動的感覺都會很不一樣
而且不一定會有（通常不會有）很大的噪音
sonication 有沒有完全要看你振的過程和結束後solution 的感覺而定
這不是很適合用文字說明... 有人帶你作比較容易
真正有做好sonication 的solution，對著光看，在手上晃動幾下就可以確認
另外一個band 不夠compact 的常見原因是製膠原料的品質
原因可已有很多種可能，而其中最常見的就是常被忽略的APS
（我還有看過pH 沒調好 or 放太久跑掉的例子，那真是夠Orz）
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年 輕 的 旅 人 之 歌：
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