Re: [問題] western blotting!! 常抽到DNA!!造成拖 …
※ 引述《phyton.bbs@ptt3.cc (要追我請先告白)》之銘言：
: 有個方法，雖然從沒耐心到試成功過 orz
: DNA太多太黏的時候可以拿個針筒重複過細小的針頭
: 把DNA攪斷，這樣應該會好些
: 把核膜溶掉一定會跑出一大堆DNA的
: 沒辦法(攤手)
想順便請教一下.... 我有兩個細胞要染一樣的抗體
其中有一個就很容易就做出來了
可是另外一個卻怎麼座都做不出來 我要做的是RTK 還有Akt
請問一下 sonicate是否為重要步驟
我的磷酸化蛋白測試結果很不穩定 有時候total還染不到> <~~~~
使用的lysis buffer和原po是一樣的
10^7 cell pellet 加入5X 量的lysis buffer(50ul) on ice 二十分鐘
14,000 rpm 20 min
測蛋白濃度 (biorad) 大概在8-12 ug/ul
loading 100 ug total protein run 8% GEL
transfer 3.5 hr (biorad) --> PVDF 10%methnol in transfer buf.
Marker都有過去 我的PT 再(140 and 70)
blocking in 5%BSA/TBST (0.01% tween20) 1h RT
1Ab in 5%BSA/TBST O/N 4C
wash 3X5' 2Ab (1:10,000 dilution pierce附贈的) 1hr RT
wash 3'X5
develope五分鐘 -->鴉片
請問一下 這個狀況下為什麼我的蛋白還是測不到??
我還要增加蛋白量嗎?? 都已經放到一百
同樣的condition 另外一個細胞株就做的很好.....請各為給點建議!!!
我已經repeat了N次了....
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※ 編輯: cytospin 來自: 164.107.154.233 (04/16 11:28)
推
04/16 13:18, , 1F
04/16 13:18, 1F
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